Identificación de la inversión del intrón 22 por medio de IS-PCR en dos familias con hemofilia A y B

Resumen

ANTECEDENTES: Las hemofilias son genopatías recesivas ligadas al cromosoma X que sobrevienen por deficiencia en la producción de los factores de coagulación. El objetivo de este estudio fue determinar la inversión del intrón 22 del factor 8 de la coagulación en dos familias con hemofilia A y B y su repercusión clínica.

MATERIALES Y MÉTODOS: Estudio observacional, descriptivo, que evaluó la alteración molecular en la inversión del intrón 22 en el gen que codifica para el factor VIII de la coagulación en tres familias con hemofilia A y B. Como control negativo se utilizaron individuos sanos. Se tomó muestra de sangre periférica de cada miembro de la familia y del paciente, se aislaron los leucocitos de los que se extrajo ADN. Se hizo reacción en cadena de la polimerasa in situ (IS-PCR) mediante restricción con la enzima BclII, los fragmentos digeridos fueron ligados con T4 ligasa y finalmente se realizó PCR inversa con primers específicos para los tipos 1 y 2 de la inversión del intrón 22.

RESULTADOS: En la familia 1, el paciente tuvo inversión del intrón 22 tipo 2, la madre fue positiva y portadora de ésta, una hija del paciente fue negativa a la inversión del intrón 22 y la otra positiva con tipo 2. En la familia 2 el paciente tuvo inversión del intrón 22 tipo 2, la hermana, madre y abuela del paciente eran portadoras de ésta y dos tías y una prima fueron negativas. En la familia 3, el paciente tenía hemofilia B moderada, dos hermanas y la madre fueron negativas para inversión del intrón 22. Los individuos sanos fueron negativos.

CONCLUSIONES: La inversión del intrón 22 tipo 2 fue la más frecuente en los pacientes con hemofilia A severa. La técnica de IS-PCR para el estudio de la inversión del intrón 22 constituye una herramienta útil y confiable en el análisis de pacientes y familias afectadas con hemofilia A severa porque permite caracterizar en una sola muestra de sangre el tipo de inversión del intrón 22 (tipo 1 o 2) del paciente.

PALABRAS CLAVE: Hemofilia; factores de coagulación; PCR.

Abstract

BACKGROUND: Hemophilias are recessive genopathies linked to the X chromosome that occur due to deficiency in the production of coagulation factors. The objective of this study was to determine the coagulation factor 8 intron 22 inversion (Inv22) in two families with hemophilia A and B and its clinical impact.

MATERIALS AND METHODS: Observational, descriptive study that evaluated the molecular alteration in intron 22 inversion in the gene that codes for coagulation factor VIII in three families with hemophilia A and B. Healthy individuals were negative controls. Peripheral blood samples were taken from each member of the family as well as from the patient, leukocytes were isolated from which DNA was extracted. In situ-PCR was performed by restriction with the enzyme BclII, the digested fragments were ligated with T4 ligase and finally inverse PCR was performed with specific primers for types 1 and 2 of intron 22 inversion.

RESULTS: In family 1, the patient had intron 22 inversion type 2, the mother was positive and a carrier of Inv22 type 2; one the two daughters of the patient was negative for Inv22 and the other was positive for Inv22 with type 2. In family 2, the patient had Inv22 type 2, the patient’s sister, mother and grandmother were carriers of Inv22 type 2, two aunts and a cousin were negative for Inv22. In family 3 the patient had moderate hemophilia B, two sisters and the mother were negative for Inv22. Healthy individuals were negative for intron 22 inversion.

CONCLUSIONS: Inv22 type 2 was the most frequent in patients with severe hemophilia A. The in situ-PCR technique for the study of Inv22 is a useful and reliable tool in the analysis of patients and families affected by severe hemophilia A, since it allows the characterization of the type of intron 22 inversion (type 1 or 2) of the patient in a single blood sample.

KEYWORDS: Hemophilia; Coagulation factors; PCR.